【摘要】 目的 探讨糖尿病引发的中枢神经系统损伤的机制。方法 采用糖尿病大鼠模型，于60天后取脑组织切片，用免疫组化的方法检测NF-κB，并进行图像分析。结果 糖尿病大鼠海马区神经元NF-κB的表达明显增加，与正常对照组相比差异有显著性(P＜0.05)。结论 NF-κB在糖尿病大鼠海马神经元表达增加表明其在慢性糖尿病脑损伤病理过程中起着非常重要的作用。
【关键词】 糖尿病；NF-κB
【Abstract】 Objective To study the expression of NF-κB in neurol cell damage in diabetic rat’s hippocampus.Methods Diabetic group consisted of 10 rats of 6 weeks old with fasting blood glouse(FBG) higher than 16.8mmol/L and normal group consisted of 10 normal wister rat with FBC lower than 6.0mmol/L.Rat were killed at 14 weeks old and observe the expression of NF-κB in hippocampus neuronal.Results The expression of NF-κB increased in diabetes group.The increases of NF-κB were positively correlated(P＜0.05).Conclusion NF-κB may play an important role in the neurol damage in hippocampus of diabetic rat.
【Key words】 diabetes；NF-κB
近年来，随着糖尿病人群中老年痴呆发病率的日益增多，人们对糖尿病引起的脑组织损伤这一事实也越来越重视。其主要表现为痴呆及精神疾患等慢性脑病的症状。本研究以糖尿病动物模型为研究对象观察NF-κB在海马神经元中表达，来探讨糖尿病引发的中枢神经系统损伤的机制。
1 材料与方法
1.1 材料 (1)动物：Wister大鼠20只(中国医科大学动物所)体重(150±20)g。(2)仪器：Olmps显微镜，MIAS-2000型图形分析仪。(3)试剂：兔抗NF-κBp65多克隆抗体(武汉博士德公司)，链脲左菌素(STZ)(Sigma)，ABC试剂盒(武汉博士德公司)。
1.2 模型制备 大鼠禁食6h，以pH＜4.6，0.1mmol/L枸橼酸钠缓冲液溶解链脲佐菌素(STZ)成1%溶液［1］，以60mg/kg腹腔注射，48h后测全血血糖(One Touch Ⅱ血糖仪)≥167mol/L时纳入实验组，以后不予特殊治疗，也不进行糖尿病饮食控制，每2周剪尾测血糖、体重。
1.3 分组与处理 将雌性Wister大鼠20只按体重随机分组，一组10只制备糖尿病模型，糖尿病成模后60天取脑组织海马区行免疫组化检测。
1.4 检测指标
1.4.1 组织切片的制备 成模大鼠及正常对照组以4%多聚甲醛心内灌注固定后取出大脑。沿冠状位额极后7～10mm将大鼠脑组织切成5mm厚度的组织块。低温石蜡包埋。连续冠状切片厚约5μm。做HE染色，光镜下观察病理变化。
1.4.2 免疫组织化学 按ABC试剂盒说明，取石蜡白片按程序脱蜡，微波抗原修复，正常山羊血清封闭，加入大鼠NF-κBp65抗体37℃孵育1h(50μl/片，稀释度1：100)置于4℃冰箱孵育24h，用0.01M PBS替代一抗做为阴性对照；辣根过氧化酶(HRP)标记的链霉卵白素工作液孵育37℃ 1h，少量暗环境下显色，显微镜下观察显色程度，以计算机图像分析仪MPIAS-500检测积分吸光度值。
2 结果
2.1 一般观察 糖尿病组大鼠呈明显多饮、多尿、多食，体重下降，皮毛污秽无光泽，成模1个月后即出现行动迟缓，而正常对照组无三多一少症状，生长与营养状况良好。
2.2 血糖与体重 见表1。
表1 血糖与体重 (x±s) 2.3 光镜观察与免疫组化 糖尿病组神经元细胞大小不一，形态有所改变，呈梭形、三角形、不规则形。神经元细胞既有肿胀，也有皱缩。正常对照组免疫组化显示NF-κB一直存在于胞浆，无明显的核移位，细胞完整排列整齐，无变形。NF-κB免疫组化结果0.272±0.04。糖尿病组大鼠海马区神经细胞皱缩，核浓染，NF-κB明显从细胞浆移位于胞核。NF-κB免疫组化结果(0.281±0.03)与正常对照组比较差异有显著性(P＜0.05)。见图1A～2B。 图1A 正常对照组NF-κB在海马区齿状回神经元的表达(20倍) 图1B 慢性糖尿病大鼠组NF-κB在海马区齿状回神经元的表达(20倍) 图2A 正常对照组NF-κB在海马区齿状回神经元的表达(40倍)
图2B 慢性糖尿病大鼠的NF-κB在海马区齿状回神经元的表达(40倍)
3 讨论
糖尿病可引起全身多脏器结构和功能的损害，而糖尿病引起的中枢神经损害越来越受到人们的关注，荷兰Erasmus大学医学院流行病学及生命统计学科Ott教授对692例55岁以上的2型糖尿病患者做了为期2年的追踪观察，发现痴呆126例，其中被诊为阿尔茨海默病者89例，将年龄、性别及其他因素予以调整后发现2型糖尿病患者痴呆危险性增加为8.9%。临床多表现为认知功能障碍。因此，研究糖尿病中枢神经病变的机制有重要的临床意义。
核录因子κB(nuclear factor-κB)最初是由Sen等［2］发现的，他在实验中发现B细胞核提取物有一种能与免疫球蛋白κ轻链基因的增强κB序列特异结合的蛋白因子，命名为NF-κB。NF-κB属Rel蛋白家族成员，由多肽p50和p65亚基形成。NF-κB的抑制物IκB包括6种成分，分别是IκBα、IκBβ、IκBγ、IκBδ、IκBε及Bcl-3。其中IκBα是NF-κB的主要调控抑制蛋白。细胞在静息状态下，NF-κB以无活性的潜在状态存在于细胞浆中，IκBα与NF-κB二聚体结合成三聚体复合物，以无活性的形式存在于胞质中，阻止NF-κB进入胞核与目标基因启动子区域的特定序列结合，从而抑制NF-κB的转录活性。当细胞受到氧自由基、细菌、内毒素、前炎症细胞因子如白介素(IL)-2等的刺激后被激活，经历快速移至核内，结合在被诱导基因启动子序列上与之相同的κB位点，致转录增加，蛋白质合成增加。
近年来的研究发现，正常情况下在神经细胞，脑血管内皮细胞和胶质细胞中均有NF-κB的存在。本研究发现糖尿病组大鼠海马区神经细胞皱缩，核浓染，NF-κB明显从细胞浆移位于胞核。而正常对照组免疫组化显示NF-κB一直存在于胞浆。无明显的核移位，细胞完整排列整齐，无变形。这一结果证实了慢性糖尿病能引起海马区神经元NF-κB的活化。提示NF-κB的激活在慢性糖尿病脑损伤机制中可能发挥了重要的作用。其可能的机制为高血糖可使细胞产生活性氧蔟(ROS)增多［3］。ROS的产生可导致IκBα磷酸化和降解以及NF-κB的核内聚集，致使促炎转录因子-NF-κB活性增强，从而产生一系列促炎症反应，使许多促症因子及炎症标志物如TNF-α、IL-6、CRP、PAI-I等增加。
通过本研究发现：NF-κB与慢性糖尿病所致的脑损伤有密切的联系。参与慢性糖尿病中枢神经系统损伤的病理过程，因此，对于慢性糖尿病后NF-κB激活的机制应进行深入的研究，寻找到拮抗其病理生理作用的关键靶点，并切实有效地应用于临床。将对防治慢性糖尿病引起的认知功能障碍具有重要的理论和临床意义。
【参考文献】
1 王吉埔，杜兵，詹文华，等.药物性大鼠糖尿病模型.中华实验外科杂志，1986，3：127-131.
2 Thons D，Maniatis T.NF-κB：A lesson in family values.Cell，1995，80：529-532.
3 Yerneni KK，Bai W，Khan BV，et al.Hyperglycemia-induced action of nuclear transcription factor kappa B in vascular smooth muscle cells.Diabetes，1999，48：855-864.