戚振云1，鲍文华1，刘跃忠2，刘 岩3，刘伟时 【摘要】 目的 探讨HO-1在肺腺癌组织中的表达状况。方法 采用反转录－多聚酶链式反应（RT-PCR）方法检测27例单纯肺腺癌组及10例正常对照组织（距癌组织大约10cm）中HO-1 mRNA表达水平。结果 37例标本均进入半定量结果分析。肺癌组mRNA表达量（0.84±0.03），正常对照组HO-1 mRNA表达量为（0.39±0.02），两组有显著性差异（P<0.05）。结论 HO-1在肺腺癌中明显的高表达，为防治肺癌提供新思路。
【关键词】 肺腺癌；血红素氧合酶-1；逆转录-多聚酶链式反应
【Abstract】 Objective To investigate the expression of HO-1 mRNA in pulmonary adenocarcinoma.Methods Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to detect HO-1 mRNA expression in specimens from 27 pulmonary adenocarcinoma and 10 normal tissues around the pulmonary adenocarcinoma away about 10cm.Results All the 37 specimens were involved in the analysis of half quantity results. The relative contents of HO-1 mRNA was (0.84±0.03) and (0.39±0.02) in 27 pulmonary adenocarcinoma and 10 normal tissues around the cancer.Significant difference existed between the two groups.（P<0.05）.Conclusion HO-1 mRNA expression content was significantly high.
【Key words】 pulmonary adenocarcinoma；hemeoxygenase-1；RT-PCR
血红素氧合酶(hemeoxygenase，HO)是一种血红素降解的催化酶和限速酶，可将血红素分解成一氧化碳(carbon monoxide，CO)、胆红素和铁。已发现HO有3种同工酶［1］，分别为HO-1、HO-2及HO-3。HO-1在呼吸系统疾病中已有广泛研究，而在肺腺癌实体中HO-1表达情况尚未有文献报道。为探讨HO-1在人肺癌组织中的表达状况，我们采用RT-PCR方法检测27例肺腺癌及正常组织中HO-1 mRNA的表达情况，结果报告如下。
1 资料与方法
1.1 病理资料 肺腺癌组：选择2004～2005年黑龙江省佳木斯市肿瘤结核医院肺癌手术标本，组织学诊断采用1981年WHO肺癌组织学分类标准。正常对照组：为肺腺癌手术患者中余10例无其他基础性疾病，在远离癌组织约10cm取肺组织。均为手术切除后立即取材，液氮冷冻。
1.2 引物序列及合成 HO-1引物依照文献［2］设计的序列，由北京奥科生物技术有限责任公司合成，引物序列如下：上游引物：5’-CGG GCC AGC AAC AAA GTG-3’；下游引物：5’-AGT GTA AGG ACC CAT CGG AGA A-3’，扩增片段长度为107bp。β-actin内参照引物，由北京奥科生物技术有限责任公司合成，上游引物：5’-TCC TCC CTG GAG AAG AGC TA-3’，下游引物：5’-TCA GGA GGA GCA ATG ATC TTG-3’，扩增的目的片段长度为302bp。
1.3 组织总RNA的抽提 试剂合购自宝生物（大连）公司。取100mg冷冻保存的组织标本，在液氮内研磨，取90mg加入已装好1ml Trizol的EP管中，剧烈振荡，静置5min，用1ml针筒抽吸2次。加入200μl氯仿，用力摇晃15s，静置2~3min，12000r/min 4℃离心15min，将上清移入另一EP管中，加入500μl异丙醇，静置10min，12000r/min 4℃离心10min，弃上清，加入75％乙醇1ml洗RNA 2次，7500r/min 4℃离心5min，干燥RNA，加无RNA酶的水30μl在60℃孵育10min，琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA质量，紫外分光光用紫外/可见光分光光度计检测A260、A280，确定RNA纯度及浓度。所有实验中的塑料制品都经1%DEPC处理后高压灭菌。
1.4 逆转录－多聚酶链式反应（RT-PCR） 取1μg总RNA进行逆转录反应，逆转录产物取5μl进行PCR。使用50μl反应体系同时扩增HO-1和β-actin，PCR的具体循环参数为：94℃ 4min，94℃ 30s，59.5℃ 45s，72℃ 45s，30个循环，末次循环延伸时间为72℃ 7min。循环完成后，取5μl PCR产物进行电泳、照相、扫描，用YLN-2000凝胶成像分析系统进行分析，结果以HO-1/β-actin的积分吸光度（AHO-1/Aβ-actin）表示。
1.5 统计学方法 本实验数据采用均数J标准差（x±s）表示，应用SPSS软件对数据进行处理，采用方差分析、t检验。
2 结果
2.1 RNA质量及含量鉴定 提取出的RNA经琼脂糖凝胶电泳显示5s、18s、28s 3条电泳带，RNA经紫外分光光度计测定吸光度A260/A280＞1.8。
2.2 肺癌及肺正常组织HO-1 mRNA的表达 HO-1 mRNA经RT-PCR扩增后，被扩增的片段为107bp，产物经测序与欲扩增片段cDNA序列一致。内参基因β-Actin同时电泳作为内部对照，所有组织标本均有表达，其产物电泳图像见图1，相对含量见表1。
图1 HO-1 mRNA表达水平表1 HO-1 mRNA水平与β瞐ctin水平积分光密度值比 （x±s） 注：与正常组织相比，*P<0.05
3 讨论
HO是一种血红素降解的催化酶。在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)和细胞色素P450还原酶及分子氧作用下，HO催化血红素降解为胆绿素、CO和铁。已发现HO有3种同工酶，分别为HO-1、HO-2及HO-3。HO-1为诱导型，HO-2和HO-3为结构型，它们是不同基因编码的产物。现已证实HO-1是一种应激蛋白，重金属、热休克、过氧化物、紫外线、高盐、缺氧、高氧、氧化低密度脂蛋白、过氧亚硝基以及HO的底物——血红素和血红蛋白等作用下，HO-1适量表达可以减轻细胞损伤、蛋白质氧化及脂质过氧化。
肺是HO-1重要表达器官之一，在呼吸系统许多疾病中均有较深入的研究，但在肺癌方面的研究甚少。我们采用RT-PCR方法检测HO-1 mRNA在实体肺腺癌组织中的表达，半定量分析结果为在肺腺癌组织中（0.84±0.03），在肺正常组织中（0.39±0.02），差异有显著性（P<0.05）。本实验证明在人肺癌实体肿瘤体内HO-1表达情况明显高于正常肺组织。
HO-1在肺腺癌中增高可能机制为：（1）肿瘤细胞释放出某些细胞因子；（2）肿瘤细胞生长失控导致低氧；（3）肿瘤细胞生长迅速，血供相对不足，促进VEGF合成及受体的敏感性增强。上述均有促进肿瘤生长的作用。Makoto Sunamura等［3］报道HO-1在胰腺癌细胞中表达明显增强，并可促进人类胰腺癌血管生成。另有文献报道［4］用肿瘤促进剂Cr（Ⅳ）处理正常肺细胞株LL-24，可使其HO-1水平明显升高，而人肺腺癌细胞株A549中的HO-1水平即使不经Cr（Ⅳ）诱导出明显高于LL-24。因此我们考虑HO-1在肺腺癌组织中可能有促进肿瘤生长的作用，为防治肺癌可提供一条新的思路。【参考文献】 1 Ying Shan，Richard W. Lambrecht， Tahereh Ghaziani，et al.Role of Bach-1 in Regulation of Heme Oxygenase-1 in Human Liver Cells. J Biol Chem，2004，279(50)：51769-51774.
2 Elbirt KK， Bonkovsky HL. Heme oxygenase： recent advances in understanding its regulation and role. Proc Assoc Am Physicians，1999，111(5)：438-447.
3 Makoto Sunamura， Dan G. Duda， Aivel H. Ghattas， et al. Heme oxygenase-1 accelerates tumor angiogenesis of human pancreatic cancer. Angiogenesis，2003，6：15-24.
4 甄国华，张珍祥.血红素氧合酶-CO通路与呼吸疾病.国外医学·呼吸系统分册，2000，20（4）：204-206.