作者：苏承武，唐永梅，蔡 捷，唐东平【摘要】 目的 探讨ATP-生物荧光法（ATP-TCA系统）在消化道恶性实体肿瘤体外药物敏感性试验中的应用。s法 取肝癌、胃癌、直肠癌、结肠癌共39例患者的手术标本，应用ATP-TCA系统方法做药物敏感性试验。结果 ATP-TCA的可评估率为92.31%；6种试验用化疗药物的敏感率分别为：丝裂霉素12.50%，紫杉醇23.33%，顺铂30.77%，羟喜树碱42.31%，5-氟尿嘧啶51.85%，表阿霉素61.54%。结论 ATP-生物荧光法可用于消化道恶性实体肿瘤化疗药物的筛选。
【关键词】 ATP-生物荧光法；恶性实体肿瘤；化疗
【Abstract】 Objective To study the application of the ex vivo ATP-bioluminescence assay(ATP-TCA) in the chemotherapy of digestive tract malignant solid tumor.Methods The surgical specimens of 39 patients，including primary liver cancer，gastric carcinoma，colic and rectal carcinoma，were tested by the ATP-TCA.Results Evaluable test results were achieved in 36 of 39 patients，the evaluability rate was 92.31%.The sensitive rates of mitomycin C (MMC)，paclitaxel (TXL)，cisplatin (CDDP)，camptothece (HCT)，5-fluoruracil (5-FU)，epirubicin (EPI)，was 12.50%，23.33%，30.77%，42.31%，51.85%，61.54%，respectively.Conclusion ATP-TCA is a good option in the chemotherapeufic agents screening of digestive duct malignant solid tumor.
【Key words】 ATP-bioluminescence assay；malignant solid tumor；chemotherapy
化学药物治疗是消化道恶性实体肿瘤治疗的重要手段之一，体外化疗药物敏感性试验是实现个体化治疗，提高临床治疗效率的重要方法，在本研究中，我们以对消化道恶性实体肿瘤有较高评估率的三磷酸腺苷生物荧光法（ATP-TCA），应用于39例消化道恶性实体肿瘤化疗药物的筛选，以期为临床化疗提供参考依据。三磷酸腺苷（ATP）是活细胞的基本能量单位，当细胞的代谢受损时，ATP合成下降，细胞死亡时受酶的作用，ATP迅速水解消失，ATP水平与活细胞数量呈正相关，因此测定细胞内源性ATP含量，可反映细胞活性和活细胞的数量。ATP体外药敏试验的原理是细胞内ATP与荧光素—荧光素酶复合物作用产生可测荧光，检测荧光值计算出化疗药物对肿瘤细胞的抑制作用［1，2］。
1 资料与方法
1.1 一般资料 收集2003年3月～2004年12月在我院住院的患者39例，男36例，女3例，肝细胞癌22例，胃癌8例，直肠癌5例，结肠癌4例，均为手术标本。
1.2 材料 ATP-TCA诊断试剂盒（包括改良PRMI 1640培养基）由北京金紫晶生物技术有限公司提供。MPL-1型自发光分析仪为德国Berthold公司产品。化学药物包括丝裂霉素（MMC，日本协和发酵工业株式会社）、紫杉醇（TXL，澳大利亚FH科贸有限公司）、羟喜树碱（HCT，广西东兰制药厂）、顺铂（CDDP，深圳市生物谷医药有限公司）、5-氟尿嘧啶（5-FU，南通制药总厂）、表阿霉素（EPI，浙江海政制药）。
1.3 方法 ATP-TCA操作步骤（按诊断试剂盒使用说明操作）：取肿瘤组织标本，在无菌条件下，剥离肿瘤组织的纤维、脂肪及结缔组织，然后用剪刀将肿瘤组织尽可能剪成小碎块，过200目钢网后放入肿瘤组织解离酶液中，置37℃、5%CO2、95%湿度下孵育1.5~3h。在4℃、1500r/min条件下，离心20min，弃上清液，重复两次，制成细胞悬液，取35μl用台盼蓝染色，倒置显微镜下计数，并观察细胞活性。调整细胞至20～40万个/ml浓度，以每孔0.1ml接种至96孔培养板内。按400%、200%、100%、50%、25%、和12.5%的血浆峰值浓度，将药物加入培养孔中，每个浓度3个平行孔和对照孔，于5%CO2、37℃、95%湿度下孵育6～7天。加入肿瘤细胞ATP提取液0.1ml，混匀后室温下15min，取0.05ml混合液置微板荧光分析仪检测。
1.4 ATP-TCA结果评估
1.4.1 应用ATP-TCA的条件 （1）检测的标本必须经细胞学和病理学证实为s性肿瘤，且混悬液中肿瘤细胞数>20%；（2）培养板MO对照必须可观察；（3）药物活性的剂量反应曲线必须可观察；（4）平行孔间CV值<20%。
1.4.2 ATP-TCA药物敏感和耐药的解读 （1）药物敏感定义：高AUIC（抑制曲线下面积）值，低IC90、IC50和SI（敏感指数）值，和高TGI（肿瘤生长抑制）值（表示肿瘤细胞生存100%抑制）。（2）药物耐受定义：低AUIC值，高IC90、IC50和SI值，和低TGI值（特别是在高测试浓度和弱剂量反应时）。（3）敏感度分级，定义为：强敏感：IC90≤100% TDC（测试肿瘤药物浓度）和IC50≤25% TDC。部分敏感：IC90>100% TDC和IC50≤25% TDC。弱敏感：IC90≤100% TDC和IC50>25% TDC。耐药：IC90>100% TDC和IC50≤25% TDC。
2 结果
在收集的39例患者中，36例具有可评估性，总可评估率为92.31%。ATP-TCA 试验结果显示不同个体对不同的化疗药物具有不同的敏感性和异质性，以下4个图为示范的肝癌（见图1）、胃癌（见图2）、直肠癌（见图3）、结肠癌（见图4）病例。图1示羟喜树碱高度敏感，图2示表阿霉素高度敏感、丝裂霉素中度敏感；图3示5-氟尿嘧啶高度敏感、顺铂中度敏感；图4示紫杉醇高度敏感、5-氟尿嘧啶中度敏感。本研究的肿瘤生长抑制率的剂量—效应曲线结果，显示不同患者对不同药物表现出程度不同的敏感性和耐受性。在所有测试的化疗药物中，它们的敏感率排序如下：表阿霉素（EPI）61.54%，5-氟尿嘧啶（5-FU）51.85%，羟喜树碱（HCT）42.31%，顺铂（CDDP）30.77%，紫杉醇（TXL）23.33%，丝裂霉素（MMC）12.50%。其中表阿霉素的敏感率最高，丝裂霉素的敏感率最低，提供的报告结果有待于临床随访和评估。
图1 肝癌
图2 胃癌
图3 直肠癌
图4 结肠癌3 讨论 自20世纪60年代以来，相继建立的各种体外药敏试验为肿瘤的临床个体化治疗提供了越来越多的选择，寻找与临床相关性好的方法是药敏试验的方向。近年发展起来的ATP-生物荧光法（ATP-TCA），是根据荧光素—荧光素酶复合物作用产生可测定荧光（波长562nm）的原理，通过检测荧光值计算出ATP量可反映活细胞数的体外药敏试验方法。其具有敏感、快速简便、与临床相关性较好的特点，能检测出不同药物浓度对细胞作用的剂量—效应关系，最小检出细胞数为40个，实验变异系数小于8.2%，预测准确率高（90.6%）［3g。我们应用北京金紫晶生物技术有限公司提供的ATP-TCA检测试剂盒，对临床所见的39例消化系恶性实体肿瘤进行体外药敏的检测，体会到ATP-TCA法有以下的优点：（1）成功率及可重复性高，达97%；（2）细胞用量少（1.5～2.5）×1011/L；（3）药物浓度呈线性范围更大，有6个细胞级数，判断趋势明显；（4）干扰因素少；（5）采用荧光检测范围较大，且可定量；（6）改良的RMPI 1640培养基可选择性地促进肿瘤细胞生长，并抑制纤维细胞、血细胞的生长以减少干扰［4］。研究结果表明，ATP-生物荧光法用于消化系恶性实体肿瘤的体外化疗药物筛选在方法学上是可靠的［5］，同时，在指导个体化疗、探讨抗癌药物相互作用等生物学特性方面都有深入研究的价值。【参考文献】 1 Sevin BU，Peng ZL，Perras JP，et al.Application of ATP-bioluminescence assay in human chemosensitivity testing.Am J Obstet Gynecol，1997，176(4)：759-766.
2 Sevin BU，Peng ZL，Perrsas JP，et al.Application of ATP-bioluminescence assay in human chemosensitivity testing.Gynecol oncol，1998，31：191-204.
3 刘珊玲，彭芝玲，王和，等.三磷酸腺苷生物荧光液闪计数法检测活细胞数.华西医科大学学报，2000，31(2)：260-261.
4 邵长君，田海梅，傅军，等.ATP-生物荧光法在筛选卵巢癌化疗药物中的应用.标记免疫分析与临床，2003，10(3)：152-155.
5 褚忠华，王捷，陈涛，等.体外药敏试验ATP-TCA在消化系恶性实体肿瘤化疗中的应用.中国实用外科杂志，2002，22(7)：418-420.