作者：李锦山 李国辉 缪英年 吴志光 李亮 【摘要】 目的 研究川芎嗪对心肌缺血大鼠模型及心肌细胞凋亡的影响。方法 建立大鼠心肌缺血模型，将24只d鼠按随机化原则分为对照组、高剂量组、低剂量组、假手术组。各组均测定心肌缺血和梗死范围以及CPK、LDH指标，并应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL法）测定各组心肌细胞凋亡及凋亡指数，比较各组间差异。结果 高剂量组较对照组和低剂量组能明显降低心肌缺血大鼠模型的危险指数，降低心肌中CPK、LDH的升高。高剂量组能明显降低心肌细胞的凋亡指数，对心肌细胞凋亡的保护作用均明显高于生理盐水和低剂量组，与假手术组无统计学差异。结论川芎嗪对心肌缺血大鼠模型心肌梗死有明显保护作用，其作用机制可能与抗心肌细胞凋亡作用有关。
【关键词】 心肌缺血；川芎嗪；心肌；凋亡
【Abstract】 Objective To research the effects of tetramethylpyrazine (TMP) on anti-myocardial ischemia rats and anti-myocardial apoptosis.Methods Established a model of myocardial ischemia rats and 24 rats were divided into 4 groups randomly with control group, high-dose group, low-dose group, sham operated group. Determined the myocardial ischemia and myocardial infarction areas and the content of CPK and LDH in all rats. And detected myocardial apoptosis with the terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) technique of all rats. Then infered their apoptosis index. Compared difference with each group. Results High-dose group could result in marked reduction of risk index，the content of CPK and LDH and apoptosis index of myocardial cells. The high-dose group had protective effects on myocardial cells is and it and higher than the control group and the low-dose group. And the high-dose group has no statistical difference compared with the sham operated group. Conclusions The TMP have obviously protective effects in myocardial infarction on the myocardial ischemia rats. The mechanism possible related to the effects of anti-myocardial apoptosis.
【Key words】 Myocardial ischemia;TMP;Myocardial;Apoptosis
川芎嗪为中药川芎的有效成分，化学结构为四甲基吡嗪( tetramethylpyrazine,TMP)。TMP具有较强的心血管系统药理作用［1-2］。本文就TMP对心肌缺血大鼠模型及心肌细胞凋亡的保护作用作探讨。
1 材料与方法
1.1 药物与试剂川芎嗪注射液，规格为40 mg/2 ml，TUNEL法测定凋亡试剂盒，购自Promega公司。磷酸肌酸激酶(CPK)试剂盒,乳酸脱氢酶( LDH)试剂盒，均购自南京建成生物工程研究。
1.2 大鼠心肌缺血模型制备 参考专著［3］制备大鼠心肌缺血模型制备，使用200~250 g SD大鼠用3％戊巴比妥钠(1.5 ml／kg)腹腔内注射麻醉，气管切开并插管，连接于小型动物呼吸机，调节呼吸频率为80～90次／min，开胸暴露心脏，用小圆针穿0号丝线，在冠状静脉走行处平左心耳间下缘1～2 mm浅层心肌进行缝线结扎，建立心肌缺血模型，心电图ST段明显抬高或T波高耸作为冠状动脉结扎成功的标志，阻断血流3 h后取下心脏。用于心肌梗死面积测定的大鼠心肌样本在缺血24 h后取下心脏。
1.3 实验方案 共24只雄性SD大鼠。按随机化原则分为4组，每组6只大鼠。对照组，造模前30 min给予生理盐水；高剂量组，造模前30 min腹腔注射TMP 20 mg/kg；低剂量组，造模前30 min腹腔注射TMP 5 mg/kg；假手术组，手术前给予生理盐水，手术中心脏左前冠状动脉只穿线不结扎。
1.4 心肌缺血和梗死范围测定 结扎冠状动脉24 h后，于心脏左心室注入3％Evans蓝2～3 ml确定未缺血与缺血心肌(未缺血心肌呈蓝色，缺血心肌呈白色)。将离体心脏置于-20℃下保存1 h，分离缺血心肌与未缺血心肌，将缺血区心室肌以平行于房室沟的方向切成4片，每片厚1～2 mm。置人1％氯化三苯基四氮唑(TTC)磷酸缓冲液(pH7．4)中37℃水浴10～15 min。梗死区(Infarct Size，IS)不染色，未梗死区染为红色，红色区与未染色区之和为缺血区(area at risk，AAR)，梗死范围(IS／AAR％)以梗死心肌占缺血心肌面积的百分比表示。每组6只大鼠进行心肌缺血范围和梗死范围的测定,比较各组心肌缺血和梗死范围是否有差别。
1.5 生化指标检测 以匀浆器将心脏制成10％心肌组织生理盐水匀浆，测定CPK、LDH生化指标。测定方法按试剂盒说明进行。
1.6 TUNEL法测定心肌细胞凋亡指数 将心肌缺血区组织常规切片，放在二甲苯中脱腊，酒精中依次水化，蒸馏水放摇床上冲洗后放入37℃烤箱中15 min。将蛋白芀（20 μg/ml）覆盖在组织上，放入37℃烤箱中30 min。加入PBS液放摇床上冲洗，在封闭液（20%小牛血清+5%奶粉）中封闭2 h，加入PBS液放摇床上冲洗，将配好的凋亡试剂（1号液：2号液=1：10）覆盖在组织上(每张片至少15 μl),放入37℃烤箱中90 min，PBS液放摇床上避光冲洗d用染色剂DAPI覆盖组织（每张片10 μl左右）避光静置2 min,用PBS液冲洗2 min，加甘油后封片，在荧光显微镜下拍片观察。然后计算凋亡指数(Apoptosis Index，AI)，AI=凋亡细胞数／细胞总数×100％。 1.7 统计学方法 所有计数资料均采用均数士标准差表示，使用统计软件SPSS11．0进行统计分析，以one-way ANOVA方法进行总体比较，q检验做组间比较，以P<0．05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 危险指数及CPK、LDH值 结果说明高剂量组较NS组能明显降低心肌缺血大鼠模型的危险指数（梗死区/危险区），降低心肌CPK、LDH，高剂量的川芎嗪对心肌缺血大鼠模型心肌梗死有明显保护作用（见表1）。
2.2 TUNEL凋亡指数结果 分析方差分析及q检验后，高剂量组与假手术组无统计学差异，其他各组两两比较匀有统计学差异。结果说明高剂量组能明显降低心肌细胞的凋亡指数，对心肌细胞凋亡的保护作用均明显高于生理盐水和低剂量组，与假手术组无统计学差异（见表2、图1）。
3 讨论
本研究测定心肌缺血大鼠模型的危险指数（梗死区/危险区），结果说明20 mg/kg TMP可以明显降低心肌缺血大鼠模型的危险指数。急性心肌缺血后，CPK、LDH活性明显升高，代表细胞损伤的开始，最终导致细胞死亡和组织坏死，所以酶的漏出被认为是细胞完全坏死前的改变［3］。本研究中，20 mg/kg TMP可以明显降低心肌缺血大鼠心肌CPK、LDH，对心肌缺血大鼠模型心肌梗死有明显保护作用。
急性心肌缺血和心肌梗死等心血管疾病存在心肌细胞凋亡［4］，细胞凋亡是心肌缺血过程中心肌细胞死亡的形式之一,心肌缺血诱发心肌细胞凋亡已为多个实验所证实［6］，细胞凋亡与细胞死亡有明显不同,系一种受基因调控有序的细胞非炎症性死亡,又称程序性细胞死亡。对心肌细胞凋亡的研究近几年才成为研究热点,为探索各种心脏疾病病理机制及药物防治开拓了一条新途径。本研究中TUNEL结果说明20 mg/kg TMP能明显降低心肌细胞的凋亡指数，对心肌细胞凋亡的具有保护作用。
本研究利用大鼠在体心脏缺血模型,发现川芎嗪高剂量组能明显缩小心肌梗死范围，同时具有明确抗缺血损伤心肌细胞凋亡的作用,说明川芎嗪对于心肌缺血损伤保护作用与其抑制缺血损伤所致心肌细胞凋亡有关。为川芎嗪在临床上进一步应用提供了理论依据,但其具体作用机制还不明确,值得进一步探讨。
参 考 文 献
［1］ 王质良,关超然,陈孟勤.川芎嗪对心血管系统的作用.生理科学进展,1992,23(4):313.
［2］ Pang PK,Shan JJ,Chiu KW.Tetramethypyrazine,a calciumantagonist.Planta Med,1996,62(5):431.
［3］ 王秋静，吕文伟，路航,等．心同贴对麻醉犬急性心肌梗死的保护作用．中国临床康复，2003，7(21)：290-291.
［4］ Olivetti G，Quairri F，Sala R，et al．Acute myocardial infarction in human is associated with activation of programmed myocyte cell death in the surviving portion of the heart.JM of Cell cardiol，1996，28：2005-2016．
［5］ NaKanuraM，Wang Np，Zhao Zq，et al．Preconditioning decreases Bax expression PMN accumulation and apoptosis in reperfused rat heart.Cardio Vasc Res，2000,45：461-470．
［6］ Fliss H, Gattinger D. Apoptosis in ischemic and reperfused rat myocardium.Circ Res 1996; 79: 949-956.
［7］ Kajstura J, Cheng W, Reiss K et al. Apoptotic and necrotic myocyte celldeaths are independent contributing variables of infarct size in rats. Lab Invest 1996; 74: 86-107.