【摘要】 目的 研究雌黄（As2S3）能否诱导急性粒细胞白血病细胞株（HL-60）凋亡与坏死。方法 以不同浓度的As2S3在不同的时间处理体外培养的HL-60细胞株，应用细胞生长测定、形态学观察及流式细胞仪检测等多种方法，在体外研究As2S3对HL-60细胞凋亡和增殖抑制的作用。通过对细胞进行Annexin V和碘化丙锭（PI）双重染色，应用流式细胞仪可以区分活细胞、凋亡细胞与坏死细胞。结果 2.5μmol/L As2S3作用18h后诱导HL-60小部分细胞凋亡和大部分细胞坏死，7.5μmol/L As2S3作用8h后可引起HL-60细胞凋亡。结论 As2S3可诱导HL-60细胞凋亡与坏死，有必要进一步探索其对急性粒细胞白血病治疗的价值。
【关键词】 雌黄(三硫化二砷)；HL-60细胞；凋亡
Experimental study on As2S3 (Orpiment) induced apoptosis and necrosis of human leukemia cell line HL-60
【Abstract】 Objective The current study was designed to investigate whether As2S3(Orpiment) will induce apoptosis and necrosis of human acute myloid leukemia cell line HL-60. Methods Acute leukemia cell line HL-60 was used as in vitro model. HL-60 cell line was treated with As2S3 at different concentrations and different period，and cell growth was analyzed with trypan blue exclusion. Apoptosis was assessed with cell morphology （including microscope and electron microscope）and flow cytometry，the latter can distinguish live cell，apoptotic cell and necrotic cell through double staining of Annexin V and propidium iodide，of which fluorescent intensities were measured on flow cytometry.Results 2.5μmol/L of As2S3 could induce most of cell HL-60 necrosis and a small part of cell apoptosis within 18h，7.5μmol/L As2S3 could induce apoptosis of human leukemia cell line HL-60 within 8 hours.Conclusion It is necessary to study further the therapeutic value of As2S3 on acute myloid leukemia. Since it can induce apoptosis and necrosis of HL-60 cell.
【Key words】 As2S3 (Orpiment)；HL-60 cell；Apoptosis
近年来对急性早幼粒细胞白血病（APL）的治疗方面的有关研究取得了重大进展，全反式维甲酸、三氧化二砷以及复方青黛片（主要成分为As4S4）对APL治疗均有较高完全缓解率，尤其后两者对APL治疗作用，主要是通过凋亡来实现的［1］，因此诱发细胞凋亡已成为白血病治疗的新思路。本研究旨在进一步探索中药雌黄(又称黄砷，主要成分为As2S3)在体外对急性粒细胞性白血病细胞株HL-60的凋亡与坏死作用。
1 材料与方法
1.1 制剂 As2S3（上海化学试剂公司）配成500μmol/L的储存液，过滤灭菌，4℃存放备用，临用前稀释成所需浓度。
1.2 细胞培养及细胞生长状况测定 HL-60细胞（由江苏省血液研究所陈子兴教授惠赠）细胞以2×105/ml接种于RPMI1640培养液（10%胎牛血清，100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素）中培养（37℃、5%CO2）。加药后逐日取药物处理组与对照组细胞台盼蓝染色，光镜下计数活细胞总数连续6天，绘制生长曲线。
1.2.1 细胞形态观察及流式细胞仪测定 培养细胞经3.0μmol/L As2S3孵育一定时间后收集2×106细胞PBS洗2遍，1500r/min离心5min，弃上清，4℃2%戊二醛固定72h后，1%锇酸固定，梯度脱水，EPON-812包埋，超薄切片，铀和铅双重染色后透射电镜下观察。Annexin-V标记 按Immuno-tech公司的说明书进行，1×106细胞用冰PBS洗2次，调整细胞浓度为1×106/ml，加5μl Annexin V（1：10稀释）和5μl碘化丙锭（PI）（250μg/ml）于490μl细胞悬液中，放置冰浴10min，用流式细胞仪(型号COULTER EPICS-XL)分析细胞凋亡情况。
1.2.2 杀伤力检测 以MTT（四甲偶氮唑蓝）比色法检测As2S3对HL-60细胞的杀伤率。将生长良好的HL-60细胞以2×105/ml浓度加入96孔培养板，每孔100μl，加入不同浓度的As2S3，每一浓度设3个复，并设对照孔，置37℃、5%CO2条件下培养48h，加入MTT（5mg/ml）10μl/孔，继续孵育2h后，再加入DMSO 100μl/孔，打匀后酶标仪（型号Micro ReaderTM 4Plus）570nm处读吸光度A值。并利用对数几率图解法测定药物的半数抑制浓度（IC50）。
2 结果
2.1 As2S3对HL-60细胞增壮的抑制作用 经0.5μmol/L As2S3处理的HL-60细胞生长受到轻微抑制，经1μmol/L 、2μmol/L As2S3处理的HL-60细胞生长受到明显抑制（见图1），As2S3处理48h，对HL-60细胞的IC50为1.23μmol/L。
2.2 形态学变化 HL-60细胞经As2S3处理后，在透射电镜下可见典型的凋亡形态学特征：细胞固缩，胞浆浓缩，染色质聚集，核碎裂，有的形成凋亡小体（见图２），亦可见到坏死细胞(见图3)。在倒置显微镜下可见凋亡细胞体积缩小，胞膜完整，细胞折光度明显加深，坏死细胞膜破裂，活细胞则细胞透亮、折光度好。 图1 As2S3对HL-60细胞的增殖抑制作用
图2 HL-60凋亡细胞超微结构(×8000) 图3 HL-60坏死细胞超微结构(×8000) 2.3 流式细胞仪结果 由于本实验采用了法国Immuno-tech公司试剂盒对细胞进行Annexin V与PI双重染色，故可以对活细胞、凋亡细胞与坏死细胞进行区分。As2S3浓度分别为2.5μmol/L、5.0μmol/L、7.5μmol/L与HL-60细胞培养18h，HL-60细胞凋亡率分别为3.24%、3.5%、5.75%，细胞坏死率分别为62.9%、76.9%、88.7%，其空白阴性对照组凋亡率与坏死率分别为1.53%、0.91%；As2S3浓度分别为2.5μmol/L、5.0μmol/L、7.5μmol/L、10.0μmol/L、15.0μmol/L与HL-60细胞培养8h，HL-60细胞凋亡率分别为3.41%、6.03%、15.0%、27.1%、35.5%，细胞坏死率分别为1.81%、2.81%、4.47%、16.5%、16.4%；其空白阴性对照组凋亡率与坏死率分别为1.1%、0.75%。
3 讨论
细胞凋亡是当前肿瘤研究中的热点之一，恶性肿瘤细胞凋亡受阻是恶性肿瘤的重要成因之一。目前有学者提出了促进细胞凋亡是治疗肿瘤的新途径，并已经发现很多因素可以不同程度地诱发肿瘤细胞的凋亡，有的由于对肿瘤细胞诱导凋亡程度较低而不满意，因此选择凋亡诱导率高的药物显得极为重要。
砷剂长期以来被认为是一种致癌物质，可致细胞内某些重要酶失活、干扰细胞代谢，使染色体畸变等［2］。上海血研所对As2O3治疗APL作了深入研究，并认为是诱发APL细胞凋亡，下调APL细胞bcl-2表达，降解PML-RARα蛋白［3］，其PML-RARα蛋白可能是抑制细胞凋亡的癌蛋白［3］。郝红缨、刘辉等［4，5］均证实砷剂对急性早幼粒细胞白血病细胞有诱导凋亡的作用。
近年来，我国学者［6，7］率先在世界上分别报道了As2O3与复方青黛片(主要成分As4S4)治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)的疗效，其中前者治疗APL，完全缓解率达65.6%，后者完全缓解率达98.3%，两者均是通过砷剂而实现，两者对APL的疗效不一样，其中As4S4疗效明显好于As2O3，但目前这两种砷剂均仅对APL有较好疗效，对其他类型白血病基本无效，据此有必要进一步探索其他砷剂等物质对白血病及其他肿瘤的基础与临床研究。
在细胞凋亡实验中，流式细胞仪在细胞凋亡研究中是具有准确客观的判断指标，而电镜指标更直观、最可靠，我们用流式细胞仪观察7.5μmol/L As2S3作用HL-60细胞8h即有15.0%细胞凋亡，而同时行MTT时结果则几乎没有抑制作用。细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）迁移到细胞外侧，因此可以利用对PS有高度亲和力的磷脂结合蛋白Annexin V检测细胞凋亡，在凋亡早期即可发现细胞凋亡。但坏死细胞PS亦暴露于外表使Annexin V结合阳性，因此仅使用Annexin V这一参数不能区分坏死与凋亡细胞，必须同时采用PI这一参数将坏死细胞与凋亡细胞区分开来。凋亡细胞PI低染，坏死细胞高染，在流式细胞仪图上表现为活细胞Annexin VˉPIˉ，凋亡细胞Annexin V+PIˉ，坏死细胞Annexin V+PI+，本方法可区分凋亡、坏死及活细胞各组分［8］，故其指标较敏感。随着作用时间延长细胞凋亡比例下降而细胞坏死比例却大幅增加，故推测细胞坏死是凋亡细胞的继发性坏死所致。
细胞生长曲线图示As2S3对HL-60细胞具有增殖抑制作用，其抑制作用主要是通过细胞凋亡与坏死来实现的，为其进一步用于临床提供了理论依据和实验模型，但其具体机理是否与陈国强等［2］报道相同以及它是否具有一定的临床价值有待进一步深入研究。【参考文献】 1 陆道培，王勤，刘延芳，等.中国急性早幼粒细胞白血病的治疗进展.北京大学学报（医学片版），2002，34：427-430.
2 Dong JT，Luo XM. Effects of arsenic on DNA damage and repair in human fetal lung fibroblasts. Mutat Res，1994，315：11-15.
3 Chen GQ，Zhu J，Shi XG，et al. In vitro studies on cellular and molecular mechanisms of arsenic trioxide (As2O3) in the treatment of acute promyelocytic leukemia. As2O3 induces NB4 cell apoptosis with down regulation of Bcl-2 expression and modulation of PML-RARalpha/PML proteins. Blood，1996，88：1052-1061.
4 郝红缨，滕智平，陆道培.PML-RARα合蛋白在三硫化二砷诱导的NB4细胞凋亡中的作用研究.中国实验血液学杂志，2002，10：108-111.
5 刘辉，邱镜滢，陆道培，等.砷剂治疗急性早幼粒细胞白血病过程中细胞形态学及遗传学变化.中华肿瘤杂志，2003，25：163-167.
6 张鹏，王树叶，胡龙虎，等.三氧化二砷注射液治疗72例急性早幼粒细胞白血病.中华血液学杂志，1996，17：58-60.
7 黄世林，郭爱霞，向阳，等.复方青黛片为主治疗急性早幼粒细胞白血病的临床研究.中华血液学杂志，1995，16：26-28.
8 郑骏年，谢叔良，陈家存，等. Annexin V 联合PI染色法定量检测凋亡细胞.上海免疫学杂志，1999；19（1）：31-34.