作者;周文柱，孙立，苏伯固，冯秉安【摘要】 目的 拟通过对α－萘异硫氰酸酯(ANIT)诱导大鼠肝损伤发病机理的探讨，对引起肝损伤的因素进行系统的研究。方法 选择S-D大鼠，雄性，随机分4组，检测数据以平均值±标准差表示，采用方差分析，相关分析进行统计学处理。结果 Ｓ-Ｄ大鼠经ANIT染毒后，病理切片显示肝损伤明显，汇管区有大量中性粒细胞浸润。经金石散及地塞米松治疗后，生化指标均有所下降，中药金石散优于地塞米松，血生化指标与PLA2活性相关分析显示，呈正相关。结论 ANIT诱导的肝毒性损伤程度与肝组织匀浆PLA2活力呈正相关，应用抑制剂降低PLA2活力，肝损伤程度也减轻，中药金石散具有降低PLA2活性，减轻肝毒性损伤。
【关键词】 ANIT； 肝损伤； 磷脂酶A2； 金石散
A study of ANIT-induced liver injury in rats and the protective effect of herb
【Abstract】 Objective To search the factors of liver injury via the ANIT-induced liver injury in rats.Methods Male Sprague-Dawley rats，were divided into 4 groups，data were analyzed using a completely randmized factorial ANOVA and linear correlation.Results After ANIT intoxication，the necrosis of hepatic cell and neutrophil infiltration im periportal region of the liver were observed in liver setions.Jinshisan can reduce the ALT，the TBIL.PLA2 correlated positively with ALT、AKP and TBIL.Conclusion The severity of ANIT-induced liver injury correlated positively with the PLA2.Jinshisan can protect against the rat ANIT-induced liver injury.
【Key words】 ANIT； liver injury； PLA2； Jin shi san
肝毒性损伤在临床工作中经常会遇到，是肝硬化、门脉高压等严重危害人民健康疾病的基础性病变。本实验以大鼠为研究对象，探讨α－萘异硫氰酸酯(ANIT)诱导肝毒性损伤的机理，观察大鼠血清ALP、AKP、TBIL的变化，以及肝组织匀浆PLA2活性与上述生化指标之间的关系。同时研究中药金石散在ANIT诱导肝毒性损伤中有何作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物 采用雄性S-D大鼠，体重200~250g（大连医科大学动物实验中心提供）。
1.2 主要试剂和仪器 ANIT(北京通县育才精细化工厂)； 卵磷脂（上海沪通研究所）； 地塞米松（天津药业有限公司）； 金石散（大连医科大学附属二院中药制剂室）； 721分光光度计（上海第三分析仪器厂）；数字显示酸度计（PXJ-IB型）（郑州电子仪器厂）。
1.3 实验方法
1.3.1 动物分组 采用雄性S-D大鼠72只，体重200~250g，普通饲养，随机分成４组，每组18只，分别为：(1)空白组，(2)模型组，(3)金石散治疗组，(4)地塞米松治疗组。首先，用香油配制ANIT溶液，浓度为20mg/ml，按100mg/kg体重，（2）、（3）、（4）组一次性灌胃染毒。2天后，每组断颈处死大鼠6只，进行各项检查。余下的大鼠处理如下：（1）、（2）组予以灌注生理盐水，1.0ml/100g体重/d，分2次灌胃。（3）组予以金石散20mg/100g体重/1.0mlNS/d，分2次灌胃。（4）组予以地塞米松0.05mg/100g体重/1.0mlNS/d，分两次灌胃。于4天后、6天后分批断颈处死大鼠，留血清检测肝功能生化指标，取肝脏做组织匀浆检测PLA2活性及光镜检查。
1.3.2 肝功能的血清生化指标测定 血清丙氨酸氨基转移酶－赖氏比色法； 血清碱性磷酸酶－磷酸苯二钠法； 血清总胆红素-甲醇法。
1.3.3 PLA2的测定 采用改进的微量测定法进行。
1.3.4 肝组织的光镜检查 光镜：取新鲜肝组织，切成0.5cm厚的小块，置10%甲醛固定液中，常规石蜡包埋切片，HE染色。
1.4 统计学方法 每组数据均以平均值±标准差表示。用方差分析和相关分析进行统计学处理，以P<0.05为显著性判定标准。
2 实验结果
2.1 实验大鼠血清生化指标的变化
2.1.2 血清丙氨酸氨基转移酶（ALT） S-D大鼠经ANIT染毒后2天，ALT迅速升高，是空白组的5.39倍(P<0.01)，４天后，ALT已开始下降但仍是空白组的3.77倍(P<0.01)，而金石散、地塞米松治疗组ALT下降更加迅速，与模型组比较差异有显著性(P<0.01)，６天后，模型组与地塞米松组差异已无显著性，而模型组与空白组差异有显著性(P<0.01)，模型组与金石散组差异仍有显著性(P<0.01)，但有所接近。见表１。表1 大鼠血清ALT活性 （U/L，x±s）注：n=6，与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01 2.1.2 血清碱性磷酸酶(AKP) 大鼠染毒2 天后，AKP增加与ALT 相似，是空白组的3.2倍(P<0.01)。４天后已趋下降，但模型组与各组比较差异有显著性(P<0.01)。６天后，已恢复正常，差异无显著性(P>0.05)。见表２。表2 大鼠血清AKP (U/L，x±s) 注：n=6，与模型组比较，**P＜0.01 2.1.3 血清总胆红素（TBIL） 大鼠经ANIT染毒2天后，TBIL明显增加，接近空白组的８倍(P<0.01)。４天后，有所降低，但中药组和地塞米松组下降更快，与模型组比较差异有显著性(P<0.01)。６天后，仍维持４天后的状况。见表３。表3 大鼠血清TBIL (mg/dl，x±s) 注：n=6，与模型组比较，**P＜0.01 2.2 大鼠肝组织匀浆PLA2的变化 大鼠染毒2天后，肝组织匀浆PLA2活性明显增强，与空白组比较差异有显著性(P<0.01)，４天后，模型组与其他各组比较差异有显著性(P<0.01)。６天后，已经趋于正常水平。见表４。表4 大鼠肝组织的PLA2活性 (U，x±s) 注：n=6，与模型组比较，**P＜0.01 2.3 大鼠血清生化指标与肝组织PLA2关系 血清ALT、AKP、TBIL与肝组织匀浆PLA2呈正相关，相关系数分别为 γALT=0.61，γAKP =0.577，γTBIL=0.593 结果见图1~3。 图1
图2图3 2.4 肝组织病理学变化 光镜下，可见空白组肝组织肝小叶结构完整，中央静脉周围有放射状排列的肝细胞索，窦间隙均匀、清晰，肝细胞体积较大，呈多边形，大圆形核居中，胞浆丰富，汇管区清晰可辨，无明显炎细胞浸润。模型组肝细胞发生广泛的水样变性，胞浆疏松化及混浊肿胀，肝细胞体积增大，使肝细胞索增粗变宽，而肝窦受压狭窄，甚至消失，能见到一定量的坏死灶，汇管区可见大量的中性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞浸润，胆管上皮增生明显。应用金石散、地塞米松组，肝损伤程度明显恢复较快，肝细胞肿胀逐渐减轻，窦间隙逐渐清晰，胞浆疏松化焖样化逐渐好转，汇管区炎细胞渗出明显减轻，胆管上皮增生减少。
3 讨论
3.1 ANIT诱导大鼠肝损伤模型的适用性 肝毒性损伤模型的建立是完成本实验的基础。本实验以血清ALT、AKP、TBIL和肝组织形态学改变为指标，确认肝损伤是否形成，并以此进行动态观察。利用ANIT 诱导动物肝损伤模型在国内已有报道［1］。本次实验采用ANIT 100mg/kg体重，灌胃使大鼠染毒，2天后，大鼠血清ALT、AKP、TBIL明显升高(P<0.01)，光镜下可见肝细胞变性坏死，汇管区大量炎细胞浸润，胆管上皮损伤伴增生性改变。
由于ANIT诱导肝损伤是急性肝损伤，具有自限性，染毒４天后，血清ALT、AKP、TBIL有所下降，病理切片肝细胞变性坏死，汇管区炎细胞浸润，胆管上皮损伤及增生有所减轻，但仍表现为典型的肝损伤状态(P<0.01)。６天后，以上各项指标与空白组比较仍有差异。上述结果表明，本实验模型急性肝损伤明显，损伤期能满足实验药物观察期限，效果满意。
3.2 PLA2在ANIT诱导大鼠肝损伤中的作用 ANIT诱导肝损伤机理仍不完全清楚。研究发现ANIT诱导的肝损伤表现为肝实质细胞，胆管上皮细胞坏死，汇管区大量中性粒细胞浸润［2］。ANIT诱导的肝损伤是中性粒细胞依赖性的肝损伤，ANIT在体外能使中性粒细胞活化，进一步发现由活化中性粒细胞释放的细胞因子如组织蛋白酶Ｇ、弹力蛋白酶对体外培养的肝细胞具有毒性作用［3］。
作为肝毒性损伤介质的中性粒细胞在肝损伤中如何发挥作用？过去曾提出过不同解释由于中性粒细胞浸润而诱发的肝细胞损伤，其一是由于中性粒细胞粘附于内皮细胞而导致血管狭窄、血流减少，但后来的实验并不支持这种观点；另一是粘附的中性粒细胞可产生活性氧与蛋白酶活性增加，但后来的实验证明，当炎症细胞浸润致肝损伤时，脂质过氧化程度比由过氧化物所引起的程序低一个数量级，因而认为活性氧并非导致肝细胞损伤的主要原因，目前认为蛋白酶可能是中性粒细胞介导的细胞毒性的重要因素。
中性粒细胞要引起肝毒性损伤需三个基本过程：(1)某些外源性化学物质诱发中性粒细胞在肝脏内蓄积。(2)中性粒细胞穿透内皮细胞并蓄积于肝窦。(3)中性粒细胞粘附并诱发肝细胞损伤。这三个基本过程缺一不可，假如阻断其中任何一过程，就能减轻肝细胞毒性损伤。
PLA2存在于所有研究过的细胞内，在许多疾病中发挥重要作用。PLA2能调节炎性细胞的活化及炎症介质的产生和释放［4］。PLA2催化膜磷脂产生的花生四烯酸经脂氧合酶和环氧化酶作用产生大量炎症介质，包括氢过氧化合物、白三烯（LTS）、前列腺素（PGS）和血栓素（TXS）等类物质，均有不同程度的致炎及炎症趋化作用［5］。另外，PLA2在催化生成花生四烯酸的同时，又可生成溶血卵磷脂，继而转化为血小板活化因子（PAF）［6］。
糖皮质激素具有抑制免疫反应，稳定溶酶体膜，抗内毒素血症作用，可起到保护肝细胞，减轻肝细胞坏死作用。糖皮质激素对大鼠血清磷脂酶A2的张力具有抑制作用［7］。实验中对经ANIT 诱导肝损伤的大鼠使用地塞米松治疗后，肝组织PLA2活力下降，同时肝细胞坏死程度减轻，汇管区中性粒细胞浸润减少，血清生化指标下降，呈正相关，以上情况均说明，PLA2在ANIT诱导的肝损伤中发挥一定的作用。
3.3 金石散对ANIT诱导肝损伤的作用机制 大鼠经ANIT诱导产生肝损伤，经中药金石散治疗后，血清ALT、AKP、TBIL明显下降。光镜下，肝细胞、胆管上皮细胞变性坏死程度明显减轻，汇管区中性粒细胞浸润减少，同时肝组织中PLA2活力也降低。说明中药金石散对ANIT诱导的肝损伤具有保护作用。金石散是我院研制开发的治疗胆结石药物［8］，具有清热解毒、舒肝利胆、利湿退黄功效，能降低胆汁通中胆红素和黏液含量。
金石散对ANIT诱导肝损伤的机制可能通过降低PLA2张力，进而减少中性粒细胞在汇管区的聚集及与肝细胞的粘附，减轻肝细胞损伤。另外，金石散还可通过促进胆汁分泌，减轻胆管扩张，从而缓解胆管上皮细胞损伤。因此金石散的保护作用较糖皮质激素明显。总之，金石散对肝损伤的保护作用部分是通过降低PLA2活力发挥作用的，与糖皮质激素作用相似，同时还通过其他途径发挥作用，具体机制有待进一步探讨。
4 结论
ANIT诱导的肝毒性损伤程度与肝组织PLA2活力增高呈正相关，应用PLA2抑制剂降低PLA2活力的同时，肝损伤程度也减轻，表明PLA2在ANIT诱导肝毒焖鹕酥蟹⒒又匾作用。中药金石散通过降低PLA2活力保护肝细胞免受毒性损伤。 【参考文献】 1 杨新波，黄正明，曹文斌，等.CCl4、D—Gal、ANIT对化学性肝损伤小鼠血清生化指标的影响.世界华人消化杂志，1998，6（1）：19-21.
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