作者：张效良，李苌青，殷秀，谢勇恩，沈成义，黄丹丹，林丽【摘要】 目的 以透明质酸为基质，研制对胃黏膜屏障更具保护作用的新制剂，探索透明质酸对黏膜的保护作用，拓展透明质酸新的应用范围。方法 复制大鼠应激性胃黏膜急性出血性糜烂损伤的动物模型，制定胃黏膜损伤程度分级标准和研究制剂有效性判定标准。实验前对实验组动物灌饲研究制剂3ml，对照组以等量生理盐水灌胃。同时设立模型对照组验证模型。24h后处死动物观察胃黏膜外观形态变化；切片观察胃黏膜病理组织学改变。结果 实验组胃黏膜外观良好，未见明显黏膜糜烂和出血灶；对照组则可见散在出血点和黏膜完整性的破坏；模型对照组出现全胃广泛出血，黏膜表面覆盖大量凝血块。实验组有效率为90%；对照组有效率为22%。统计学检验，P＜0.05。结论 实验结果显示“胃屏复”对应激性胃黏膜损伤具有明显的保护作用。由此表明，透明质酸可替代胃黏膜屏障的糖蛋白基质而具有重要的应用开发价值。
【关键词】 透明质酸；制剂；形态学观察；动物模型
Preparation of protecting gastromucosa and observation its effect on protecting of acute stress gastromucosa damage in rats
【Abstract】 Objective Used hyaluronic acid as matrix， WEIPINGFU， a new preparation of protecting gastromucosa，was studied.Methods The animal model of acute stress gastromucosa damage was reconstructed. The standards of the gastromucosa damage and the protecting effect was worked out. The animals of experimental group were poured the WEIPINGFU 3ml into the stomach，and NS 3ml were poured into it in contrast group before the experiment. The animals were treated after 24 hours，then the changes of the gastromucosal morphology and pathologic histology were observed.Results The appearance of gastromucosa was fine and intact；there weren’t obvious gastromucosal erosion and bleeding points in the experimental group. It was seen a lot of spread bleeding points and destroy of gastromucosa in the contrast group. The effective rate of the former is 90%；but the latter is 22%(P＜0.05).Conclusion The test preparation has clearly the protecting effect to the gastromucosa damage.
【Key words】 hyaluronic acid；preparation；morphologic observation；animal model
胃炎、胃黏膜糜烂、出血、胃溃疡等疾病是危害人类健康的常见病、多发病。而不同病因导致胃病变具有共性的特征是胃黏膜屏障的受损。目前市售的许多药品也正是基于保护和修复受损胃黏膜屏障而发挥治疗作用。因此，人们从未停息对胃黏膜屏障更具保护作用的新型材料和制剂的研究和探索。本项研究就是以透明质酸为基质，佐以胃黏膜细胞营养剂等物质而研制的类似天然胃黏膜屏障理化性质的一种新型制剂（关于制剂的理化特征和药剂学资料另文发表）。为了便于表述，暂将该制剂定名为“胃屏复”。众所周知，正常胃黏膜屏障是由胃上皮细胞、泌酸腺的黏液颈细胞和贲门、幽门腺共同分泌的以糖蛋白和碳酸氢盐为主要成分的凝胶构成。它在胃表面形成厚度约500μm的凝胶层，一方面减少粗糙食物对胃黏膜的机械性损伤；另一方面有效地保护胃黏膜免受胃酸和胃蛋白酶的损害。本研究制剂的基质透明质酸是广泛存在于动物体内的一类大分子粘多糖，在溶液中，因其分子存在众多交联键而形成分子网状结构，这就使透明质酸溶液同时具有凝胶弹性和溶液粘性的双重特性［1］。这种特征与正常胃黏膜屏障的糖蛋白基质十分类似。因此，探索和研究透明质酸治疗胃疾病是对此类大分子粘多糖应用领域的新的拓展。目前也尚未查见类似报道。
1 材料与方法
1.1 动物 SD大鼠，雌雄不限，平均体重120g（购自四川大学华西医学中心）。
1.2 研究制剂 本研究制剂基质为人脐带透明质酸，本室提取，理化特性达到制剂标准［2］。其他试剂均为国产分析纯。
1.3 动物模型复制及标本处理［3］ 大鼠于实验前禁食48h，仰缚于鼠板，浸入20℃左右水中，水面高度平剑突。24h后麻醉处死。剖开腹腔，在幽门和十二指肠连接处穿线结扎。然后通过食道注入0.4%中性福尔马林8ml到胃内，结扎食道。切断食道和十二指肠摘出全胃。30min后，沿胃大弯将胃切开，平铺观察胃黏膜变化。最后将标本固定于5%福尔马林待切片镜下观察。
1.4 动物胃黏膜损伤程度评级标准有效性判断 0级：胃液清晰，黏膜表面无明显变化，偶可见部分区域呈斑片状发红，与周围黏膜境界不明显，无出血点。Ⅰ级：胃黏液淡黄，黏膜肿胀，反光增强，多处不规则片状和线状充血发红区，但无明显出血和黏膜糜烂。Ⅱ级：胃液颜色棕红，内可见小片状凝血块。黏膜上皮完整性受损，可见多处散在出血灶，出血点呈咖啡色，直径多在1mm以下。Ⅲ级：胃液呈黑褐色，内有大量凝血块。表层黏膜剥脱，黏膜面覆盖片状新鲜和陈旧出血凝块，用水冲洗后可见黏膜糜烂面。
实验组黏膜损伤在Ⅰ级以下为有效；Ⅱ级以上为无效。
1.5 实验分组 取动物30只，随机分成3组，每组10只。即：实验组、对照组和模型对照组。实验组在48h禁食后每只用研究制剂3ml灌胃；对照组采用生理盐水3ml灌胃；模型对照组不做灌胃处理。
1.6 切片方法 石蜡切片，HE染色。
1.7 统计学处理 对实验资料收集整理后采用χ2检验。
2 结果
2.1 实验后不同组别胃黏膜受损程度 实验后3组动物胃黏膜损伤外观形态变化情况见图1。
图1〓“胃屏复”对应激性胃黏膜损伤保护作用的形态变化比较 从实验标本可见，实验组大鼠胃黏膜表面外观良好，无明显黏膜糜烂和出血灶，仅在部分新鲜标本可观察到幽门部黏膜肿胀和斑状充血发红区。而对照组则可见散在出血点和黏膜完整性的破坏。模型对照组大多出现全胃广泛出血，黏膜表面覆盖大量凝血块。根据上述黏膜损伤评级标准，3组实验动物胃黏膜受损的评级情况见表1。表1 实验动物细黏膜受损的评级 (只) 注：与对照组比较P＜0.05 3组实验动物胃黏膜损伤评级分布表明，实验组大多为0级和Ⅰ级，对照组多为Ⅱ级，模型对照组多数为损伤严重的3级变化。另外，对照组有1只、模型对照组2只动物在实验过程中死亡。
2.2 实验动物胃黏膜的病理组织学变化 将上述3组实验动物胃标本分别进行病理组织学观察，结果见图2、3、4。
实验组大鼠全胃切片观察可见黏膜完整性良好，未见明显的糜烂出血灶，部分区域可见血管扩张充血 （图2）。 图2〓实验组大鼠胃黏膜病理组织学变化 图3〓对照组大鼠胃黏膜病理组织学变化 图3显示，对照组大鼠胃黏膜层糜烂出血，完整性破坏，黏膜下层充血，全胃切片可见多发出血灶。
模型对照组胃切片可见胃黏膜广泛出血，部分区域出血深达黏膜下层（图4），胃黏膜完整性严重破坏。全胃切片可见以幽门窦区域受损最重。
图4〓模型对照组大鼠胃黏膜病理组织学变化3 讨论
无论原发性胃疾病还是继发性胃损伤，黏膜屏障的受损和完整性破坏往往是最常见的病理形态学变化。因此，探索更为有效的胃黏膜屏障保护方法和制剂不仅可应用于胃疾病治疗；而且对于预防严重创伤、休克、心衰、重症感染等危重疾病向多系统器官功能衰竭（MSOF）转化也具有十分重要的意义。如前所述，本研究旨在利用透明质酸形成分子凝胶而构成细胞周基质的特性［4］，模拟和替代受损的胃黏膜糖蛋白基质，以达到保护胃黏膜屏障的目的。从结果可见，实验前灌饲“胃屏复”研究制剂的实验组胃黏膜得到了有效保护。10只动物中有9只黏膜损伤程度处于较轻微的0级或Ⅰ级。而对照组和模型对照组黏膜受损程度均为Ⅱ级和Ⅲ级。以实验有效性标准判断，那么“胃屏复”对胃黏膜损伤保护的有效率达到90%。由此表明，以透明质酸作为基质的研究制剂对胃黏膜损伤的保护作用十分明显。这不仅拓宽了透明质酸的研究领域，而且还具有重要的开发应用价值。
本项研究所采用的动物模型为应激性胃黏膜急性出血性糜烂损伤模型，这是复制胃黏膜损伤较经典实验方法。其特点是能较好地反映人类应激性胃黏膜损伤的病理形态特征。同时方法简单，成功率高，资料显示该方法成功率达90%以上［3］。在本项研究中，如果以大鼠胃黏膜损伤Ⅱ级和Ⅲ级为成功，那么模型对照组的成功率为100%。因此该模型不失为研究胃黏膜屏障保护极具实用价值的较好方法。
需要表明，本研究是将透明质酸作为胃黏膜屏障保护基质的初步实验探索。虽然透明质酸与胃黏膜屏障中的糖蛋白基质都具有粘弹性的共性特征，但前者的外源性加入和后者的内源性产生对二者与黏膜表层的附着能力之间是否存在差异，尚缺乏实验依据。同时，透明质酸是由葡糖醛酸-N-乙酰氨基葡糖为双糖单位组成的高分子多糖，而当进入胃内酸性环境后，其大分子必然逐渐降解为小分子，粘弹性也会随着分子量的下降而减小，因此如何稳定透明质酸的分子量以保持其粘弹性，也是需要进一步研究的。
【参考文献】 1 凌沛学.透明质酸.北京：中国轻工业出版社，2000，20.
2 张效良.人脐带透明质酸制备及理化性质分析.中国药房，1999，10 (1)：10.
3 郭鹞.人类疾病的动物模型(第一辑).北京：人民卫生出版社，1982，271.
4 Blazs EA.Matrix engineering. Blood Coagul Fibrinolysis，1991，2(1):173-178.